คริสเปอร์. Медицинский портал Vrachi.name

Мы используем файлы cookie.
Продолжая использовать сайт, вы даете свое согласие на работу с этими файлами.

คริสเปอร์

Подписчиков: 0, рейтинг: 0

คริสเปอร์/แคสไนน์ (CRISPR/Cas9)

แผนภาพกลไกของคริสเปอร์เป็นการป้องกันตัวจากไวรัสในโพรแคริโอต

คริสเปอร์ (อังกฤษ: CRISPR) เป็นวงศ์ของลำดับดีเอ็นเอในแบคทีเรีย ซึ่งในลำดับมีส่วนของดีเอ็นเอ (DNA snippets) จากไวรัสที่เคยโจมตีแบคทีเรียนั้น แบคทีเรียใช้ส่วนเหล่านี้ในการตรวจหาและทำลายดีเอ็นเอจากไวรัสที่คล้ายกันในการโจมตีครั้งถัดไป ลำดับเหล่านี้ทำหน้าที่สำคัญในระบบภูมิคุ้มกันของแบคทีเรีย และเป็นพื้นฐานของเทคโนโลยีที่เรียกว่า คริสเปอร์/แคสไนน์ (อังกฤษ: CRISPR/Cas9) ที่สามารถใช้เปลี่ยนยีนภายในสิ่งมีชีวิต

ระบบคริสเปอร์/แคสเป็นระบบภูมิคุ้มกัน โพรแคริโอตที่ช่วยในการต่อต้านส่วนประกอบทางพันธุกรรมแปลกปลอม เช่นเดียวกับที่อยู่ในพลาสมิด (plasmid) และ เฟจ (phages) ซึ่งเป็นภูมิคุ้มกันที่เกิดขึ้นภายหลัง (acquired immunity) อาร์เอ็นที่มีลำดับสเปสเซอร์ (spacer sequence) ช่วยโปรตีนแคส (CRISPR-associated, Cas) ในการจำแนกและตัดดีเอ็นเอจากภายนอก ขณะที่โปรตีนแคสอื่นที่นำโดยอาร์เอ็นเอตัดอาร์เอ็นเอจากภายนอก คริสเปอร์ถูกพบในประมาณ 40% ของจีโนมแบคทีเรียและใน 90% ของอาร์เคียที่ถูกหาลำดับดีเอ็นเอแล้ว

CRISPR ย่อมาจาก Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ชื่อถูกตั้งก่อนจะรู้ที่มาและหน้าที่ของลำดับย่อยอินเตอร์สเปส (interspacing subsequence) ณ ตอนนั้น คริสเปอร์ถูกมองว่าเป็นส่วนหนึ่งของดีเอ็นเอโพรแคริโอตที่มีลำดับเบสสั้น ๆ ที่เรียงตัวซ้ำ ๆ ลำดับซ้ำพาลินโดรม (palindromic repeat) เป็นลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เหมือนกันเมื่ออ่านจากทั้งสองด้าน การซ้ำแต่ละครั้งตามด้วยดีเอ็นเอสเปสเซอร์จากการพบกับดีเอ็นเอภายนอกครั้งก่อน (เช่น ไวรัส หรือ พลาสมิด) ต่อจากลำดับคริสเปอร์ก็มีกลุ่มเล็ก ๆ ของยีนแคส (CRISPR-associated system, cas)

ระบบคริสเปอร์/แคสแบบง่ายที่เรียกว่าคริสเปอร์/แคสไนน์ถูกปรับแต่งเพื่อแก้ไขจีโนม จีโนมสามารถถูกตัดในตำแหน่งที่ต้องการ โดยการส่งแคสไนน์นิวคลีเอส (Cas9 nuclease) ประกอบกับไกด์อาร์เอ็นเอ (guide RNA, gRNA) เข้าไปในเซลล์ ทำให้สามารถกำจัดยีนที่มีอยู่หรือเพิ่มยีนใหม่เข้าไปได้ กลุ่มรวม Cas9-gRNA ทำหน้าที่เหมือน กลุ่มรวม CAS III crRNA บนแผนภาพด้านข้าง

เทคนิคการแก้ไขจีโนมคริสเปอร์/แคสมีศักยภาพในการนำไปประยุกต์ใช้ในหลายด้าน รวมถึงทางการแพทย์ และทางการปรุงแต่งเมล็ดพืชทางเกษตร การใช้กลุ่มรวม CRISPR/Cas9-gRNA เพื่อแก้ไขจีโจม ถูกเลือกโดยสมาคมเพื่อความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์อเมริกัน (AAA) ให้เป็นการค้นพบครั้งใหญ่ใน พ.ศ. 2558 ข้อกังวลด้านชีวจริยธรรมถูกกล่าวถึงเกี่ยวกับความเป็นไปได้ในการใช้เทคนิคนี้เพื่อแก้ไขเซลล์สืบพันธุ์

ประวัติ

การค้นพบของกลุ่มดีเอ็นเอลำดับซ้ำเกิดขึ้นโดยอิสระในสามส่วนของโลก หนึ่งในการค้นพบครั้งแรกเกิดขึ้นเมื่อ พ.ศ. 2530 ณ มหาวิทยาลัยโอซะกะในประเทศญี่ปุ่น นักวิจัย โยชิซุมิ อิชิโนะ (Yoshizumi Ishino) และคณะเผยแพร่ผลการทดลองเกี่ยวกับลำดับของยีนชื่อว่า "iap" และความเกี่ยวข้องกับ E. coli ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีในช่วงคริสต์ทศวรรษ 1990 ทำให้พวกเขาสามารถดำเนินงานวิจัยต่อและเพิ่มความเร็วของการหาลำดับด้วยเทคนิคที่เรียกว่าเมตาจีโนมิกส์ (metagenomics) พวกเขาสามารถเก็บตัวอย่างน้ำทะเลหรือดินและหาลำดับดีเอ็นเอในตัวอย่างนั้น

กลไก

โลคัสพันธุกรรมคริสเปอร์ทำให้แบคทีเรียมีกลไกลการป้องกันตัวจากการติดเชื้อเฟจซ้ำ

อาร์เอ็นเอจากดีเอ็นเอของโลคัสพันธุกรรมคริสเปอร์และการเติบโตของ pre-crRNA

รูปร่างสามมิติของ CRISPR-Cas9 Interference Complex

ขั้นตอนของภูมิคุ้มกันคริสเปอร์สำหรับสามรูปแบบหลักของภูมิคุ้มกันแบบจำเพาะ หรือ adaptive immunity (1) การได้มาเริ่มจากการรู้จำของดีเอ็นเอบุกรุกโดย Cas1 และ Cas2 และการตัดของโปรโตสเปสเซอร์ (2) โปรโตสเปสเซอร์ถูกเชื่อมกับลำดับซ้ำโดยตรงติดกับลำดับนำ และ (3) การซ่อมแซมเพิ่มความยาวสายเดี่ยว (single strand extension repair) และการทำสำเนาลำดับซ้ำโดยตรง การแปรรูป crRNA และขั้นตอนการเข้าแทรกแซงเกิดขึ้นต่างกันในทั้งสามระบบหลักของคริสเปอร์ (4) สายอาร์เอ็นเอหลักถูกตัดโดยยีนแคสเพื่อสร้าง crRNA (5) ในระบบแบบที่ 1 Cas6e/Cas6f ตัดในจุดต่อของอาร์เอ็นเอสายเดี่ยวและสายคู่ สร้างเป็นห่วงในลำดับซ้ำโดยตรง ระบบแบบที่ 2 ใช้ trans-activating (tracr) อาร์เอ็นเอเพื่อสร้างอาร์เอ็นเอสายคู่ ซึ่งถูกตัดโดย Cas9 และ RNaseIII ระบบแบบที่ 3 ใช้คู่เหมือน Cas6 ที่ไม่ต้องการห่วงในลำดับซ้ำโดยตรงเพื่อตัด (6) ในระบบแบบที่ 2 และ 3 เกิดการตัดทุติยภูมิขึ้นที่ด้านท้าย 5’ หรือ 3’ เพื่อสร้าง crRNAs ที่สมบูรณ์ (7) crRNAs สมบูรณ์จับกับโปรตีนแคสเพื่อสร้างเป็นกลุ่มรวมเพื่อแทรกแซง (8) ในระบบแบบที่ 1 และ 2 จำเป็นต้องมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนและลำดับแพมเพื่อที่จะทำให้เกิดการทำลายดีเอ็นเอที่บุกรุกอย่างเป็นผลสำเร็จ ระบบแบบที่ 3 ไม่ต้องการลำดับแพมเพื่อทำลาย และในระบบเอของแบบที่ 3 มีการจับคู่กันระหว่าง crRNA และ mRNA แทนที่จะเป็นดีเอ็นเอที่เป็นเป้าของระบบ B ของแบบที่ 3

ภูมิคุ้มกันคริสเปอร์-แคสเป็นกระบวนการทางธรรมชาติของแบคทีเรียและอาร์เคีย คริสเปอร์-แคสป้องกันการติดเชื้อเฟจ, คอนจูเกชัน (conjugation) และการแปลงพันธุ์ทางธรรมชาติ โดยการทำลายกรดนิวคลีอิกจากภายนอกที่เข้ามาในเซลล์

การได้มาซึ่งสเปสเซอร์

เมื่อจุลินทรีย์ถูกบุกรุกโดยไวรัส ขั้นแรกของการตอบสนองของภูมิคุ้มกันคือการจับดีเอ็นเอของไวรัสและใส่เข้าไปในโลคัสคริสเปอร์ในรูปแบบของสเปสเซอร์ การที่ Cas1 และ Cas2 อยู่ในระบบภูมิคุ้มกันคริสเปอร์-แคสทั้งสองแบบ ชี้ว่าพวกมันมีส่วนในการได้มาซึ่งสเปสเซอร์ งานวิจัยการกลายพันธุ์ยืนยันสมมติฐานนี้ และแสดงว่าการนำยีน cas1 หรือ cas2 ออกทำให้ไม่สามารถจัดหาสเปสเซอร์ได้ ในขณะที่ไม่ส่งผลกระทบต่อการตอบสนองของภูมิคุ้มกันคริสเปอร์

โปรตีน Cas1 หลายโปรตีนถูกศึกษาลักษณะเฉพาะและหาโครงสร้าง โปรตีน Cas1 มีลำดับกรดอะมิโนหลากหลาย อย่างไรก็ตาม โครงสร้างผลึกมีลักษณะคล้ายกัน และโปรตีน Cas1 ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์ทั้งหมดเป็นนิวคลีเอส/อินทีเกรสที่ต้องพึ่งธาตุโลหะ และจับกับดีเอ็นเอโดยไม่พึ่งกับลำดับ โปรตีน Cas2 ที่ถูกเลือกได้รับการศึกษาลักษณะเฉพาะ และพบว่าพวกมันแสดงกิจกรรมเอนโดริโบนิวคลีเอสเฉพาะต่อ ssRNA (สายเดี่ยว) หรือ dsDNA (สายคู่)

ในระบบไอ-อี ของ E. coli Cas1 และ Cas 2 จับกันเป็นกลุ่มรวมโดยสองส่วน (dimer) ของ Cas2 จับเข้ากับสองส่วนของ Cas1 ในกลุ่มรวมนี้ Cas2 มีหน้าที่เป็นโครงสร้างแบบไม่ใช้เอนไซม์ และจับกับชิ้นสายคู่ของดีเอ็นเอจากภายนอก ขณะที่ Cas1 จับกับด้านข้างของดีเอ็เอส่วนสายเดี่ยวและช่วยเร่งในการรวมเข้ากับแถวลำดับคริสเปอร์ สเปสเซอร์ใหม่ถูกเพิ่มในส่วนเริ่มของคริสเปอร์ต่อจากลำดับนำ (leader sequence) ทำให้เป็นการบันทึกการติดเชื้อไวรัสตามลำดับเวลา

โมทีฟติดกับโปรโตสเปสเซอร์

การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศศาสตร์บริเวณจีโนมเฟจที่ถูกตัดเป็นสเปสเซอร์ (เรียกว่าโปรโตสเปสเซอร์, protospacer) ชี้ว่าไม่ได้เป็นการเลือกอย่างสุ่ม ทว่าถูกพบติดกับลำดับดีเอ็นเอสั้น ๆ (3 – 5 คู่เบส) ที่เรียกว่า protospacer adjacent motifs หรือ แพม (PAM) การวิเคราะห์ของระบบคริสเปอร์-แคสแสดงว่าลำดับแพมมีความสำคัญสำหรับระบบแบบที่ 1 (type I) และแบบที่ 2 (type II) ทว่าไม่สำคัญในแบบที่ 3 (type III) ระหว่างการได้มาซึ่งสเปสเซอร์ ในระบบแบบที่ 1 และ 2 โปรโตสเปสเซอร์ถูกตัดบนตำแหน่งติดกับลำดับแพม โดยอีกด้านหนึ่งของสเปสเซอร์ถูกตัดโดย ruler mechanism ทำให้ขนาดของสเปสเซอร์ใกล้เคียงกันในแถวลำดับคริสเปอร์ การอนุรักษ์ลำดับแพมแตกต่างกันไปในคริสเปอร์-แคสแต่ละระบบและอาจเชื่อมโยงกับ Cas1 และลำดับนำ (leader sequence)

สเปสเซอร์ใหม่ถูกเพิ่มเข้าไปในแถวลำดับคริสเปอร์โดยมีทิศทางที่แน่นอน มักเลือกที่จะ แต่ไม่เพียงแต่ ติดกับลำดับนำ การวิเคราห์ของระบบไอ-อีจาก E. coli แสดงว่าลำดับซ้ำแรกติดกับลำดับนำถูกคัดลอก โดยมี สเปสเซอร์ใหม่ที่พึ่งได้มาแทรกระหว่างลำดับซ้ำแรกและสอง

ลำดับแพมน่าจะมีความสำคัญระหว่างการแทรกสเปสเซอร์ในระบบไอ-อี ลำดับนั้นมีส่วนประกอบของนิวคลีโอไทด์ท้ายที่ถูกคงไว้ติดกับนิวคลีโอไทด์แรกของโปรโตสเปสเซอร์ นิวครีโอไทด์นี้กลายเป็นเบสสุดท้ายของลำดับซ้ำโดยตรง (direct repeat) ชิ้นแรก สิ่งนี้ชี้ว่ากลไกการได้มาซึ่งสเปสเซอร์ทำให้เกิดส่วนยื่นสายเดี่ยวในตำแหน่งรองท้ายของลำดับซ้ำโดยตรงและลำดับแพมระหว่างการแทรกสเปสเซอร์ อย่างไรก็ตาม ไม่ใช่ทุกแบบของคริสเปอร์-แคสจะใช้กลไกนี้ ด้วยความที่แพมในสิ่งมีชีวิตอื่นไม่แสดงการคงไว้ของตำแหน่งสุดท้ายในระดับเท่ากัน เป็นไปได้ว่าระบบเหล่านี้ทำให้เกิดปลายทู่ที่ไม่มีส่วนยื่นออกมาตรงส่วนท้ายของลำดับซ้ำโดยตรงและโปรโตสเปสเซอร์ระหว่างการได้มาซี่งสเปสเซอร์

การประยุกต์

ภายใน พ.ศ. 2557 มีงานวิจัยกว่า 1,000 งานที่กล่าวถึงคริสเปอร์ถูกตีพิมพ์ เทคโนโลยีถูกใช้เพื่อหยุดยั้งการปฏิบัติงานของยีนในเซลล์ไลน์มนุษย์และในเซลล์, เพื่อศึกษา Candida albicans, เพื่อปรับแต่งยีสต์เพื่อผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพ และเพื่อปรับแต่งพันธุกรรมของสายพันธุ์พืช คริสเปอร์ยังสามารถถูกใช้เพื่อเปลี่ยนยุงให้ไม่สามารถถ่ายทอดโรค เช่น มาลาเรีย

การประเมินคำอ้างใหม่สำหรับความสัมพันธ์ระหว่างยีนกับโรคบนฐานของคริสเปอร์นำไปสู้การค้นพบความผิดปกติที่อาจมีความสำคัญ

การซ่อมแซมดีเอ็นเอหลังสายทั้งสองของดีเอ็นเอขาด (double-strand break, DSB)

พันธุวิศวกรรม

การแก้ไขจีโนมโดยคริสเปอร์/แคสไนน์ใช้ระบบคริสเปอร์แบบที่ 2 โดยใช้ Cas9, crRNA, tracrRNA และอาจใช้ร่วมกับส่วนของต้นแบบการซ่อมแซมดีเอ็นเอเพื่อช่วยในการเชื่อมต่อชิ้นส่วนโครโมโซมที่ไม่ใช่คู่ของมันเอง (non-homologous end joining, NHEJ) หรือ homology directed repair (HDR) ในการแก้ไขจีโนม

ภาพรวมของการสร้างพลาสมิดคริสเปอร์ แคสไนน์

ส่วนประกอบหลัก

ส่วรประกอบ	หน้าที่
crRNA	มีไกด์อาร์เอ็นเอซึ่งหาที่ตั้งของดีเอ็นเอของโฮสต์พร้อมกับตำแหน่ที่จับกับ tracrRNA (มักอยู่ในรูปห่วง, hairpin loop) เกิดเป็นกลุ่มรวมพร้อมปฏิบัติการ
tracrRNA	จับกับ crRNA และเกิดเป็นกลุ่มรวมพร้อมปฏิบัติการ
sgRNA	ย่อมาจาก Single guide RNAs เป็นการรวมกันของอาร์เอ็นเอประกอบด้วย tracrRNA และ crRNA อย่างน้อยหนึ่งชิ้น
Cas9	โปรตีนที่รูปแบบพร้อมปฏิบัติการสามารถปรับแต่งดีเอ็นเอได้ มีหลายรูปแบบที่มีหน้าที่แตกต่างกัน (เช่น การตัดสายเดี่ยว การตัดสายคู่ การจับกับดีเอ็นเอ) เป็นผลจากหน้าที่ของ Cas9 ในการรู้จำตำแหน่งดีเอ็นเอ
ต้นแบบการซ่อมแซม (repair template)	ดีเอ็นเอที่นำกระบวนการซ่อมแซมเซลทำให้สามารถแทรกลำดับดีเอ็นเอเฉพาะได้

คริสเปอร์/แคสไนน์มักใช้พลาสมิดเพื่อบุกรุก (transfect) เซลล์เป้าหมาย ส่วนประกอบหลักของพลาสมิดแสดงอยู่ในรูปทางขวา เริ่มจากการออกแบบ crRNA สำหรับการประยุกต์ใช้แต่ละครั้งด้วยความที่สิ่งนี้เป็นลำดับที่ Cas9 ใช้เพื่อระบุและจับโดยตรงกับดีเอ็นเอของเซลล์ crDNA ต้องจับกับที่ซึ่งต้องการแก้ไขเท่านั้น ต้นแบบการซ่อมแซมถูกออกแบบสำหรับการใช้แต่ละครั้งด้วยความที่ต้องทับซ้อนกับด้านใดด้านหนึ่งที่ถูกตัดและต้องเป็นรหัสสำหรับการแทรกลำดับ

crRNAs และ tracrRNA หลายชิ้นสามารถบรรจุเข้าด้วยกันเพื่อสร้าง single-guide RNA (sgRNA) โดยสามารถนำ sgRNA นี้ไปต่อกับยีน Cas9 ในพลาสมิดเพื่อบุกรุกเข้าสู่เซลล์

ภาพรวมของการบุกรุกและการตัดดีเอ็นเอโดยคริสเปอร์แคสไนน์ (crRNA และ tracrRNA มักเชื่อมกันเป็นสายอาร์เอ็นเอเดียวขณะออกแบบพลาสมิด)

ดูเพิ่ม

Doudna, Jennifer; Mali, Prashant (23 March 2016). CRISPR-Cas: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-1-62182-131-1. {{cite book}}: ไม่รู้จักพารามิเตอร์ |name-list-format= ถูกละเว้น แนะนำ (|name-list-style=) (help)
Mohanraju P, Makarova KS, Zetsche B, Zhang F, Koonin EV, van der Oost J (August 2016). "Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems". Science. 353 (6299): aad5147. doi:10.1126/science.aad5147. PMID 27493190.
Sander JD, Joung JK (April 2014). "CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes". Nature Biotechnology. 32 (4): 347–55. doi:10.1038/nbt.2842. PMC 4022601. PMID 24584096.
Slaymaker IM, Gao L, Zetsche B, Scott DA, Yan WX, Zhang F (January 2016). "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity". Science. 351 (6268): 84–8. doi:10.1126/science.aad5227. PMC 4714946. PMID 26628643.
Terns RM, Terns MP (March 2014). "CRISPR-based technologies: prokaryotic defense weapons repurposed". Trends in Genetics. 30 (3): 111–8. doi:10.1016/j.tig.2014.01.003. PMC 3981743. PMID 24555991.
Westra ER, Buckling A, Fineran PC (May 2014). "CRISPR-Cas systems: beyond adaptive immunity". Nature Reviews Microbiology. 12 (5): 317–26. doi:10.1038/nrmicro3241. PMID 24704746.
Andersson AF, Banfield JF (May 2008). "Virus population dynamics and acquired virus resistance in natural microbial communities". Science. 320 (5879): 1047–50. Bibcode:2008Sci...320.1047A. doi:10.1126/science.1157358. PMID 18497291.
Hale C, Kleppe K, Terns RM, Terns MP (December 2008). "Prokaryotic silencing (psi) RNAs in Pyrococcus furiosus". RNA. 14 (12): 2572–9. doi:10.1261/rna.1246808. PMC 2590957. PMID 18971321.
van der Ploeg JR (June 2009). "Analysis of CRISPR in Streptococcus mutans suggests frequent occurrence of acquired immunity against infection by M102-like bacteriophages". Microbiology. 155 (Pt 6): 1966–76. doi:10.1099/mic.0.027508-0. PMID 19383692.
van der Oost J, Brouns SJ (November 2009). "RNAi: prokaryotes get in on the act". Cell. 139 (5): 863–5. doi:10.1016/j.cell.2009.11.018. PMID 19945373.
Karginov FV, Hannon GJ (January 2010). "The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea". Molecular Cell. 37 (1): 7–19. doi:10.1016/j.molcel.2009.12.033. PMC 2819186. PMID 20129051.
Pul U, Wurm R, Arslan Z, Geissen R, Hofmann N, Wagner R (March 2010). "Identification and characterization of E. coli CRISPR-cas promoters and their silencing by H-NS". Molecular Microbiology. 75 (6): 1495–512. doi:10.1111/j.1365-2958.2010.07073.x. PMID 20132443.
Díez-Villaseñor C, Almendros C, García-Martínez J, Mojica FJ (May 2010). "Diversity of CRISPR loci in Escherichia coli". Microbiology. 156 (Pt 5): 1351–61. doi:10.1099/mic.0.036046-0. PMID 20133361.
Deveau H, Garneau JE, Moineau S (2010). "CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteria interactions". Annual Review of Microbiology. 64: 475–93. doi:10.1146/annurev.micro.112408.134123. PMID 20528693.
Koonin EV, Makarova KS (December 2009). "CRISPR-Cas: an adaptive immunity system in prokaryotes". F1000 Biology Reports. 1: 95. doi:10.3410/B1-95. PMC 2884157. PMID 20556198.
"The age of the red pen". The Economist. August 22, 2015. ISSN 0013-0613. สืบค้นเมื่อ 2015-08-25.

แหล่งข้อมูลอื่น

Advanced Gene Editing: CRISPR-Cas9 Congressional Research Service
Jennifer Doudna talk: Genome Engineering with CRISPR-Cas9: Birth of a Breakthrough Technology