วัคซีนดีเอ็นเอ

วิธีการผลิตวัคซีนดีเอ็นเอสำหรับไข้เวสต์ไนล์ ดูคำแปลโดยคลิ๊กดูรูปขยาย

วัคซีนดีเอ็นเอ (อังกฤษ: DNA vaccine) เป็นวัคซีนประเภทที่นำ (transfect) ลำดับดีเอ็นเอซึ่งเข้ารหัสแอนติเจนอย่างหนึ่งโดยเฉพาะเข้าไปในเซลล์ของสิ่งมีชีวิตเพื่อกระตุ้นให้ภูมิคุ้มกันตอบสนอง

วัคซีนออกฤทธิ์โดยนำพลาสมิดเข้าไปในเซลล์ พลาสมิดได้สร้างขึ้นผ่านพันธุวิศวกรรมให้มีดีเอ็นเอซึ่งเข้ารหัสแอนติเจนที่ต้องการให้ภูมิคุ้มกันตอบสนอง โดยเซลล์จะเป็นผู้ผลิตแอนติเจนเอง วัคซีนนี้อาจมีข้อดีกว่าวัคซีนปกติ รวมทั้ง "ก่อการตอบสนองของภูมิคุ้มกันหลายรูปแบบอย่างครอบคลุมกว่า" มีวัคซีนดีเอ็นเอหลายอย่างที่ได้ทดสอบเพื่อใช้ในสัตว์แล้ว ซึ่งในบางกรณีก็ก่อภูมิคุ้มกันโรคได้จริง ๆ แต่ในบางกรณีก็ไม่ได้ มีงานวิจัยที่พยายามใช้เทคโนโลยีนี้เพื่อป้องกันโรคในมนุษย์ รวมทั้งโรคจากไวรัส แบคทีเรีย ปรสิต และมะเร็ง ในเดือนสิงหาคม 2021 รัฐบาลอินเดียได้อนุมัติให้ใช้วัคซีนโควิด-19 ชนิดดีเอ็นเอคือ ZyCoV-D ในภาวะฉุกเฉิน บริษัทยาอินเดียคือ Cadila Healthcare เป็นผู้พัฒนา เป็นวัคซีนดีเอ็นเอแรกในโลกที่อนุมัติให้ใช้กับมนุษย์

ข้อมูลพื้นฐาน

วัคซีนธรรมดาอาจมีส่วนประกอบเป็นแอนติเจนโดยเฉพาะ ๆ จากจุลชีพก่อโรค หรืออาจเป็นไวรัสก่อโรคที่ลดฤทธิ์ซึ่งกระตุ้นให้ภูมิคุ้มกันตอบสนอง วัคซีนดีเอ็นเอเป็นวัคซีนสารพันธุกรรม (genetic vaccine) เพราะมีข้อมูลทางพันธุกรรม (เป็นดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอ) ที่เข้ารหัสโปรตีนของจุลชีพที่มีภาวะเป็นแอนติเจน วัคซีนดีเอ็นเอมีดีเอ็นเอที่เข้ารหัสแอนติเจนโดยเฉพาะ ๆ จากจุลชีพก่อโรค เมื่อฉีดเข้าไปในร่างกายแล้วเข้าไปในเซลล์ กระบวนการธรรมชาติของเซลล์ก็จะสังเคราะห์โปรตีนอาศัยรหัสพันธุกรรมในพลาสมิดที่นำเข้าไปในเซลล์ เพราะโปรตีนเช่นนี้มีลำดับกรดอะมิโนที่เป็นลักษณะพิเศษของแบคทีเรียหรือไวรัส จึงทำให้ร่างกายรู้ได้ว่าเป็นสิ่งแปลกปลอม เมื่อเซลล์ผลิตโปรตีนเช่นนี้แล้วส่งไปที่ผิวเซลล์ ระบบภูมิคุ้มกันก็จะรู้ตัวแล้วเริ่มตอบสนอง

ประวัติ

ในปี 1983 นักไวรัสวิทยาที่กระทรวงสาธารณสุขรัฐนิวยอร์กได้ประดิษฐ์วิธีทางพันธุวิศวกรรมเพื่อสร้างวัคซีนดีเอ็นเอรวมใหม่ (recombinant DNA) คือได้แปลงวัคซีนฝีดาษธรรมดาให้เป็นวัคซีนที่สามารถใช้ป้องกันโรคอื่น ๆ ทำโดยแทรกยีนหนึ่งจากไวรัสอื่น ๆ (ได้แก่ไวรัสเริม ไวรัสตับอักเสบบี และไวรัสไข้หวัดใหญ่) ต่อมาในปี 1993 นักเคมีชีวภาพที่แหล็บวิจัยของบริษัทเมอร์คได้แสดงว่า การฉีดพลาสมิดที่เข้ารหัสยีนแอนติเจนของไข้หวัดใหญ่สามารถป้องกันหนูไม่ให้ติดโรค (ที่จงใจทำให้ติด) ต่อมาในปี 2016 สถาบันสุขภาพแห่งชาติสหรัฐได้เริ่มทดลองวัคซีนดีเอ็นเอเพื่อป้องกันไวรัสซิกาในมนุษย์ ซึ่งมีแผนรับอาสาสมัคร 120 คนอายุระหว่าง 18-35 ปี วัคซีนจะฉีดเข้าที่ต้นแขนด้วยความดันสูง แต่จนถึงเดือนสิงหาคม 2016 การผลิตวัคซีนให้ได้มาก ๆ ก็ยังไม่ลงตัว อนึ่ง บริษัท Inovio Pharmaceuticals และ GeneOne Life Science ได้เริ่มทดลองวัคซีนดีเอ็นเออีกชนิดสำหรับไวรัสซิกาในเมืองไมแอมี การทดลองวัคซีนดีเอ็นเอป้องกันโรคเอชไอวีก็กำลังดำเนินการอยู่อีกด้วย

ในเดือนสิงหาคม 2021 รัฐบาลอินเดียได้ลงทะเบียนให้ใช้วัคซีนดีเอ็นเอ ZyCoV-D ในภาวะฉุกเฉินเพื่อป้องกันโรคโควิด-19 โดยบริษัทยาอินเดีย Cadila Healthcare ได้พัฒนาวัคซีนนี้ขึ้น

การประยุกต์ใช้

จนถึงปี 2021 ยังไม่มีวัคซีนดีเอ็นเอที่อนุมัติให้ใช้กับมนุษย์ในสหรัฐ มีการทดลองน้อยมากที่กระตุ้นให้ภูมิคุ้มกันตอบสนองได้พอป้องกันโรค ดังนั้น เทคโนโลยีนี้จึงยังต้องพิสูจน์ว่ามีประสิทธิผลในมนุษย์หรือไม่ต่อไป แต่ก็มีวัคซีนดีเอ็นเอป้องกันโรคของม้าที่ได้อนุมัติแล้ว อนึ่ง กำลังมีการตรวจสอบด้วยว่าสามารถใช้เทคนิคนี้เพื่อแก้พิษงูได้หรือไม่ เทคโนโลยีนี้ยังสามารถใช้กระตุ้นให้ร่างกายสร้างแอนติบอดีเพื่อรักษาโรคในทำนองเดียวกับสารภูมิต้านทานโมโนโคลนอีกด้วย

ข้อดี

ข้อเสีย

• จำกัดใช้กับสารอิมมูโนเจน (immunogen) หรือแอนติเจนที่เป็นโปรตีน ไม่สามารถใช้กับแอนติเจนที่ไม่ใช่โปรตีน เช่น พอลิแซ็กคาไรด์ของแบคทีเรีย
• ร่างกายอาจตอบสนองต่อโปรตีนของแบคทีเรียหรือของปรสิตอย่างไม่คาดหมาย
• ยาฉีดจมูกแบบอนุภาคนาโนซึ่งเป็นพลาสมิดประกอบด้วยดีเอ็นเออาจมีผลต่อเซลล์ชนิดอื่นซึ่งไม่ได้ตั้งใจ เช่นเซลล์สมอง
• วัคซีนต่าง ๆ ที่เพาะด้วยสิ่งมีชีวิตอาจปนเปื้อนกันเมื่อผลิตในโรงงานเดียวกัน

มีพาหะ (เวกเตอร์) เป็นพลาสมิด

การออกแบบ

วัคซีนดีเอ็นเอก่อการตอบสนองของภูมิคุ้มกันได้ดีสุดเมื่อใช้พาหะพันธุกรรมชนิดที่เซลล์แสดงออกเป็นโปรตีนได้จำนวนมากที่สุด ปกติจะเป็นพลาสมิดอันประกอบด้วยส่วน viral promoter ที่ดีซึ่งขับการถอดรหัสและการแปลรหัสยีน (หรือ complementary DNA) ที่ต้องการ โดยอาจรวมส่วน Intron A (Interferon alfa-2b) เข้าด้วยเพื่อเพิ่มเสถียรภาพของเอ็มอาร์เอ็นเอแล้วเพิ่มการแสดงออกของโปรตีน อนึ่ง ยังอาจรวมเอาส่วน termination signal หรือ polyadenylation ที่ขับการแสดงออกโปรตีนได้ดี เช่น ฮอร์โมนควบคุมการเจริญเติบโตของวัว (bovine growth hormone) หรือ beta globulin ของกระต่าย พาหะซึ่งมียีนหลายยีนที่ต้องการซึ่งเรียกว่า polycistronic vector บางครั้งจะทำขึ้นเพื่อให้แสดงออกอิมมูโนเจนมากกว่าหนึ่งอย่าง หรือให้แสดงออกอิมมูโนเจนบวกกับโปรตีนร่วมกระตุ้นภูมิคุ้มกัน (immunostimulatory protein)

เพราะพลาสมิดสามารถบรรจุรหัสพันธุกรรมได้เพียง ~200 Kbp การออกแบบให้สามารถแสดงออกโปรตีนได้ดีสุดจึงจำเป็น วิธีหนึ่งก็คือปรับใช้โคดอนภายในเอ็มอาร์เอ็นเอของจุลชีพก่อโรคให้ได้ดีสุดสำหรับเซลล์ยูแคริโอต คือ จุลชีพก่อโรคมักมี GC-content (guanine-cytosine content) ในอัตราที่ต่างกับสิ่งมีชีวิตที่เป็นเป้า ดังนั้น การเปลี่ยนลำดับยีนของอิมมูโนเจนให้มีโคดอนเหมือนกับที่มักเกิดในสิ่งมีชีวิตอาจทำให้แสดงออกโปรตีนได้ดีกว่า

ประเด็นที่ต้องพิจารณาอีกอย่างก็คือการเลือกลำดับ promoter นักวิทยาศาสตร์ได้ใช้ลำดับยีนที่เรียกว่า SV40 promoter ที่อาจก่อเนื้องอกในลิงและมนุษย์ จนกระทั่งพบว่าส่วน promoter จากไวรัสก่อมะเร็งไก่ คือ Rous Sarcoma Virus มีอัตราการแสดงออกที่สูงกว่า ต่อมาไม่นานนี้จึงพบว่า สามารถเพิ่มอัตราการแสดงออกและการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในสัตว์ตัวแบบโดยใช้ส่วน immediate-early (MIE) promoter ของซัยโตเมกาโลไวรัส (CMV) และใช้ cis-acting transcriptional element (หรือ cis-regulatory element) จากรีโทรไวรัส (retrovirus) วิธีเพิ่มอัตราการแสดงออกของโปรตีนอื่น ๆ รวมทั้งการการแทรกลำดับ enhancer sequence, อินทรอนสังเคราะห์ (synthetic introns), ลำดับ tripartite leader (TPL) จากอะดีโนไวรัส และการเปลี่ยนปรับปรุงส่วน polyadenylation และ termination signal ตัวอย่างพลาสมิดสำหรับวัคซีนดีเอ็นเออย่างหนึ่งก็คือ pVAC (ของบริษัท InvivoGen) ซึ่งใช้ส่วน SV40 promoter

ความไม่เสถียรภาพของโครงสร้างดีเอ็นเอเป็นปัญหาสำคัญสำหรับผู้ผลิตพลาสมิด ของการฉีดวัคซีนดีเอ็นเอ และของการบำบัดด้วยยีน ส่วนต่าง ๆ ที่เป็นแกนหลัก (backbone) ของพลาสมิดอาจมีส่วนในการสร้างความไม่เสถียรภาพ รูปแบบลำดับยีนอันก่อความไม่เสถียรภาพที่รู้แล้วรวมทั้ง direct repeat, inverted repeat, tandem repeat ซึ่งพบใน cloning vector และ expression vector ที่มีขายทั่วไป ดังนั้น การลดหรือการกำจัดลำดับยีนภายในแกนหลักของพลาสมิดที่ไม่เข้ารหัสโปรตีนและไม่จำเป็น ก็จะลดโอกาสเกิดความไม่เสถียรภาพโดยตรง และดังนั้น ลดโอกาสการเกิดยีนรวมกันใหม่เนื่องกับพลาสมิด

กลไกของพลาสมิด

เมื่อพลาสมิดเข้าไปในนิวเคลียสของเซลล์แล้ว มันก็จะถอดรหัสเป็นเพปไทด์ซึ่งเป็นแอนติเจนแปลกปลอม โมเลกุลคอมเพล็กซ์ major histocompatibility complex (MHC) ทั้ง class I และ II ของเซลล์ก็จะนำแอนติเจนไปแสดงที่ผิวเซลล์ เซลล์ที่แสดงแอนติเจน (antigen-presenting cell) ก็จะเคลื่อนย้ายไปยังต่อมน้ำเหลือง แล้วแสดงแอนติเจนและโมเลกุลที่ช่วยกระตุ้น เป็นการส่งสัญญาณให้กับเซลล์ที แล้วเริ่มการตอบสนองของภูมิต้านทาน

รูปแบบโปรตีน/ดีเอ็นเอ

สารอิมมูโนเจนสามารถส่งเข้าไปยังส่วนโดยเฉพาะ ๆ ของเซลล์เพื่อเพิ่มการตอบสนองของแอนติบอดีหรือของเซลล์ทีที่ฆ่าเซลล์ (cytotoxic T-cell) แอนติเจนที่หลั่งออกหรือยึดอยู่กับเยื่อหุ้มเซลล์จะกระตุ้นการตอบสนองของแอนติบอดีได้ดีกว่าแอนติเจนที่อยู่ในไซโทซอล การตอบสนองของเซลล์ทีที่ฆ่าเซลล์อาจเพิ่มได้โดยปรับให้แอนติเจนสลายตัวในไซโทพลาซึมแล้วเข้าสู่กระบวนการส่งแอนติเจนไปที่ผิวเซลล์ของ major histocompatibility complex (MHC) class I ซึ่งปกติทำโดยเพิ่มยูบิควิติน (ubiquitin) ไปที่ยีนโปรตีนด้านเอ็น-เทอร์มินัส

คอนฟอร์เมชันของโปรตีนยังมีผลต่อการตอบสนองของแอนติบอดีอีกด้วย โครงสร้างที่เป็นระเบียบ (เช่น อนุภาคไวรัส) ได้ผลดีกว่าโครงสร้างอันไม่มีระเบียบมินิยีน (หรือ MHC class I epitopes) จากจุลชีพก่อโรคชนิดต่าง ๆ สามารถเพิ่มการตอบสนองของเซลล์ทีที่ฆ่าเซลล์เพื่อต่อต้านจุลชีพก่อโรคบางชนิด โดยเฉพาะเมื่อรวม epitope ชนิด TH เข้าไปด้วย

การส่งเข้าไปในเซลล์

วัคซีนดีเอ็นเอและการบำบัดด้วยยีนจะมีเทคนิคคล้าย ๆ กัน

มีวิธีส่งวัคซีนดีเอ็นเอเข้าไปในเนื้อเยื่อของสัตว์หลายอย่าง ในปี 1999 วิธียอดนิยมเมื่อฉีดวัคซีนดีเอ็นเอในน้ำเกลือก็คือ ใช้เข็มฉีดยาธรรมดา หรือใช้ปืนยิงยีน แต่หลังจากนั้นก็มีเทคนิคใหม่เพิ่มขึ้นเรื่อย ๆ

การฉีดดีเอ็นเอในน้ำเกลือ

วัคซีนดีเอ็นเอในน้ำเกลือปกติจะฉีดเข้ากล้ามเนื้อโครงร่าง หรือเข้าใต้ผิวหนัง เพื่อส่งดีเอ็นเอเข้าไปในร่างกายภายนอกเซลล์ ซึ่งสามารถช่วยด้วย

1. กระบวนการ electroporation
2. ทำใยกล้ามเนื้อให้เสียหายชั่วคราวด้วยพิษต่อกล้ามเนื้อ (myotoxin) เช่นยาชา bupivacaine
3. ใช้สารละลายที่ความดันออสโมซิสสูงกว่าเลือด เช่น น้ำเกลือ หรือซูโครส

ภูมิคุ้มกันจะตอบสนองต่อวิธีนี้โดยขึ้นกับปัจจัยรวมทั้งชนิดเข็มฉีดยาที่ใช้ การวางเข็ม ฉีดเร็วแค่ไหน ปริมาณการฉีด ชนิดกล้ามเนื้อ อายุ เพศ และสภาพร่างกายของผู้รับวัคซีน

ปืนยิงยีน

ปืนยิงยีน (gene gun) สามารถยิงดีเอ็นเอในพลาสมิด (pDNA) โดยมีอนุภาคทองหรือทังสเตนอันดูดดีเอ็นเอเข้าไปเป็นลูกกระสุน ให้เข้าไปในเข้าไปในเซลล์ที่ต้องการ โดยใช้ฮีเลียมอัดเป็นตัวดันกระสุน

การส่งยาทางเยื่อบุ

วิธีการส่งยาทางอื่นรวมทั้งการฉีดยาพ่นเป็นดีเอ็นเอเปล่า (naked DNA) ที่ผิวเยื่อบุ/เยื่อเมือกต่าง ๆ เช่น ที่จมูก หรือที่ปอด ยาหยอดตา และยาทาช่องคลอด ยาที่ส่งผ่านเยื่อบุได้สำเร็จแล้วรวมทั้งชนิดที่ใช้ลิโปโซมหุ้มดีเอ็นเอโดยมีประจุบวก, ไมโครสเฟียร์ที่ย่อยสลายทางชีวภาพได้, เชื้อ Salmonella ลดฤทธิ์เป็นเวกเตอร์สำหรับส่งดีเอ็นเอทางปาก, เชื้อ Shigella หรือ Listeria เพื่อใช้เป็นเวกเตอร์ทางปากสำหรับเยื่อบุลำไส้ และเวกเตอร์อะดีโนไวรัสลูกผสม

ELI immunization

expression library immunization เป็นการสร้างเวกเตอร์ที่ได้โคลนยีนต่าง ๆ อันแสดงออกโปรตีนแต่ละชนิดของจุลชีพก่อโรคแล้วฉีดเป็นวัคซีน เมื่อใช้เทคนิคนี้ ก็อาจสามารถส่งยีนของจุลชีพทั้งหมดไปที่เซลล์ได้พร้อม ๆ กัน ซึ่งอาจมีประโยชน์สำหรับจุลชีพก่อโรคที่ลดฤทธิ์หรือเพาะได้ยาก วิธีนี้ยังสามารถใช้ระบุว่า ยีนตัวไหนของจุลชีพทำให้คุ้มกันตอบสนองแล้วป้องกันโรคได้ ซึ่งใช้ตรวจสอบอย่างสำเร็จแล้วกับแบคทีเรีย Mycoplasma pulmonis ซึ่งเป็นจุลชีพก่อโรคปอดที่มีจีโนมค่อนข้างเล็กในหนู แม้แต่ expression library ที่ไม่สมบูรณ์ก็ยังสามารถสร้างภูมิคุ้มกันได้

ตารางเปรียบเทียบ

ขนาดยา

วิธีการส่งยาเป็นตัวกำหนดขนาดยาที่ต้องใช้เพื่อให้เกิดภูมิต้านทานโรค การฉีดยาในน้ำเกลือจะต้องใช้ดีเอ็นเอปริมาณต่าง ๆ กัน เริ่มตั้งแต่ 10 ไมโครกรัมจนถึง 1 มิลลิกรัม เทียบกับการใช้ปืนยิงยีนที่ใช้น้อยกว่า 100-1,000 เท่า แม้ปกติแล้วต้องใช้ 0.2-20 ไมโครกรัม แต่ก็มีรายงานว่าใช้น้อยถึง 16 นาโนกรัมอยู่เหมือนกัน โดยจะต่าง ๆ กันขึ้นอยู่กับฉีดให้สัตว์ชนิดไหน ตัวอย่างเช่น หนูใช้ดีเอ็นเอประมาณ 10 เท่าน้อยกว่าไพรเมต การฉีดผสมน้ำเกลือต้องใช้ดีเอ็นเอมากกว่าเพราะส่งดีเอ็นเอเข้าไปยังบริเวณช่องว่างนอกเซลล์ของเนื้อเยื่อที่เป็นเป้า (ปกติจะเป็นกล้ามเนื้อ) แล้วต้องผ่านอุปสรรคต่าง ๆ (เช่น ชั้น basal lamina ของสารเคลือบเซลล์ และเนื้อเยื่อเกี่ยวพันจำนวนมาก) ก่อนที่จะเข้าไปในเซลล์ได้ เทียบกับปืนยิงยีนที่ยิงดีเอ็นเอเข้าไปในเซลล์โดยตรง จึงเสียดีเอ็นเอน้อยกว่า

การตอบสนองของภูมิคุ้มกัน

เซลล์ทีเฮลเปอร์

การแสดงแอนติเจนแก่เซลล์ทีมีผลให้เซลล์กลายเป็นเซลล์ CD8+ ชนิดเป็นพิษต่อเซลล์ (cytotoxic) หรือกลายเป็นเซลล์ทีเฮลเปอร์ CD4+ เซลล์ซึ่งเป็นพิษต่อเซลล์จะเข้าทำลายเซลล์อื่น ๆ ซึ่งมีโมเลกุลแปลกปลอมหรือผิดปกติที่ผิวเซลล์ ส่วนเซลล์ทีเฮลเปอร์ หรือเซลล์ Th จะประสานการตอบสนองของภูมิคุ้มกันโดยสื่อสารกับเซลล์อื่น ๆ ในกรณีโดยมาก เซลล์ทีจะรู้จักแอนติเจนก็ต่อเมื่อแอนติเจนได้ส่งมาที่ผิวเซลล์โดยโมเลกุล MHC (major histocompatibility complex) ของร่างกายเองเท่านั้น

วัคซีนดีเอ็นเอก่อการตอบสนองของเซลล์ทีเฮลเปอร์ (T_H) หลายรูปแบบรวมทั้งการเพิ่มเม็ดเลือดขาวอย่างรวดเร็ว (lymphoproliferation) และการตอบสนองทางไซโตไคน์ในรูปแบบต่าง ๆ ข้อดีเยี่ยมของวัคซีนดีเอ็นเอก็คือสามารถจัดให้ก่อการตอบสนองของเซลล์ทีชนิด TH1 หรือ TH2 ก็ได้ โดยวัคซีนแต่ละชนิดจะทำให้มีการตอบสนองโดยเฉพาะ ๆ ในเรื่องของการแสดงออก lymphokine กับ chemokine, สารภูมิต้านทาน, การขนส่งเม็ดเลือดขาว และการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันโดยกำเนิด

การตอบสนองของเซลล์ทีอื่น ๆ

ชนิดของเซลล์ทีที่ตอบสนองจะขึ้นอยู่กับปัจจัยต่าง ๆ รวมทั้งการส่งวัคซีน ชนิดของอินมูโนเจนที่แสดงออก รวมถึงการส่งวัคซีนเข้าไปยังช่องต่าง ๆ ในต่อมน้ำเหลือง (lymphoid compartment) โดยเฉพาะ ๆ ทั่วไปแล้ว การฉีดผสมน้ำเกลือ (ไม่ว่าจะเข้าในกล้ามเนื้อหรือเข้าผิวหนัง) มักก่อการตอบสนองของเซลล์ทีชนิด TH1 และการใช้ปืนยิงยีนจะทำให้เซลล์ TH2 ตอบสนอง นี่เป็นจริงสำหรับแอนติเจนที่จับกับเยื่อหุ้มเซลล์และแอนติเจนในน้ำเลือด แต่ไม่จริงสำหรับแอนติเจนที่หลั่งออกมา ซึ่งมักจะก่อการตอบสนองของ TH2 ไม่ว่าจะส่งวัคซีนด้วยวิธีใด ๆ

ปกติแล้ว ชนิดเซลล์ทีที่ตอบสนองจะคงยืนเป็นระยะยาวโดยไม่เปลี่ยนไปเมื่อติดโรค หรือแม้เมื่อก่อภูมิคุ้มกันโดยวิธีที่ปกติจะทำให้เซลล์ทีอีกอย่างตอบสนองในบุคคลที่ไม่เคยติดโรคหรือไม่เคยได้วัคซีนมาก่อน แต่งานศึกษาปี 1995 ก็พบด้วยเหมือนกันว่าวัคซีนดีเอ็นเอที่เข้ารหัสโปรตีน circumsporozoite ของปรสิตมาลาเรียหนู คือ Plasmodium yoelii (ยีน PyCSP) เบื้องต้นทำให้เซลล์ TH2 ตอบสนอง แต่ต่อมาเปลี่ยนเป็น TH1 หลังได้วัคซีนโดสที่สอง

เหตุที่เซลล์ทีชนิดต่าง ๆ ตอบสนอง

มีเรื่องที่ยังไม่ชัดเจนหลายอย่างรวมทั้งกลไกของวิธีต่าง ๆ ตามที่ว่า, รูปแบบแอนติเจนที่แสดงออก และรูปแบบการตอบสนองของเซลล์ทีชนิดต่าง ๆ เบื้องแรกคาดว่า การฉีดเข้ากล้ามเนื้อที่ต้องใช้ดีเอ็นเอปริมาณมากเป็นเหตุให้เซลล์ทีแบบ TH1 ตอบสนอง แต่หลักฐานการทดลองกลับไม่แสดงว่าขนาดยามีผลต่อชนิดเซลล์ทีที่ตอบสนอง แต่ขึ้นอยู่กับการเปลี่ยนสภาพ (differentiation) ของเซลล์ที่แสดงแอนติเจนคือ antigen-presenting cell (APC) เซลล์เดนไดรต์ (dendritic cell ตัวย่อ DC) ซึ่งเป็น APC ชนิดหนึ่งอาจเปลี่ยนสภาพแล้วหลั่งอินเตอร์ลิวคินชนิด IL-12 ซึ่งสนับสนุนพัฒนาการของเซลล์ทีแบบ TH1 หรือหลั่งชนิด IL-4 ซึ่งสนับสนุนเซลล์แบบ TH2 คือ เมื่อใช้วิธีการฉีด pDNA เข้าไปในร่างกาย DC ก็จะกลืนมันเข้าไปผ่านกระบวนการเอนโดไซโทซิส ซึ่งจะกระตุ้นให้ให้เซลล์เปลี่ยนสภาพเพื่อผลิตไซโตไคน์ชนิด TH1 (คือ IL-12) เทียบกับปืนยิงยีนที่ส่งดีเอ็นเอเข้าไปในเซลล์โดยตรง จึงไม่กระตุ้น TH1 เยี่ยงนี้

ประโยชน์การทำให้เซลล์ทีโดยเฉพาะ ๆ ตอบสนองมากกว่า

การเกิดเซลล์ทีประเภทใดประเภทหนึ่งยิ่งกว่ามีประโยชน์ในเรื่องภูมิแพ้และโรคภูมิต้านตนเอง เมื่อมีโรคภูมิต้านตนเอง เป้าหมายการรักษาก็เพื่อเปลี่ยนการตอบสนองแบบ TH1 (คือเซลล์ทีซึ่งฆ่าเซลล์) ไปเป็นแบบ TH2 ซึ่งไม่ทำลายเซลล์ ซึ่งได้ประสบความสำเร็จแล้วในการชักนำ (priming) ให้เกิดการตอบสนองในรูปแบบที่ต้องการสำหรับสัตว์ทดลองพรีคลินิกในช่วงภาวะก่อนเกิดโรค (predisease) และได้ประสบความสำเร็จบ้างในการเปลี่ยนการตอบสนองสำหรับโรคที่เกิดแล้ว

การตอบสนองของเซลล์ทีชนิดทำลายเซลล์

ข้อดีอย่างหนึ่งของวัคซีนดีเอ็นเอก็คือสามารถทำให้เม็ดเลือดขาวชนิดทำลายเซลล์ (cytotoxic T lymphocyte, CTL) ตอบสนองโดยไม่มีความเสี่ยงเหมือนกับวัคซีนเชื้อเป็น การตอบสนองของ CTL สามารถเกิดกับเอพิโทปที่ CTL เข้าจับทั้งแบบ immunorecessive และ immunodominant ซึ่งคล้ายกับที่เกิดในการติดเชื้อตามธรรมชาติ ดังนั้น วัคซีนจึงอาจมีประโยชน์ในการตรวจสอบเอพิโทปที่ CTL เข้าจับและบทบาทของ CTL ในการสร้างภูมิคุ้มกัน

เซลล์ทีที่ฆ่าเซลล์สามารถรู้จำเพปไทด์ขนาดเล็ก (เป็นกรดอะมิโน 8-10 หน่วย) ที่เข้าคอมเพล็กซ์กับโมเลกุล MHC class I เป็นเพปไทด์อนุพัทธ์จากโปรตีนในไซโทซอลที่ได้สลายแล้วส่งไปให้โมเลกุล MHC class I ที่ยังใหม่ (nascent) ภายในร่างแหเอนโดพลาซึม (ER) การส่งผลิตภัณฑ์ยีนเข้าไปที่ ER โดยตรง (โดยสอดใส่ลำดับ ER insertion signal sequence ทางด้านเอ็น-เทอร์มินัส) สามารถเพิ่มการตอบสนองของ CTL ซึ่งประสบความสำเร็จแล้วกับไวรัสลูกผสม vaccinia ที่แสดงออกโปรตีนไข้หวัดใหญ่ โดยหลักการนี้ก็ควรจะใช้ได้กับวัคซีนดีเอ็นเอด้วย การจัดให้แอนติเจนเสื่อมภายในเซลล์ (และดังนั้น จึงสามารถเข้าไปในวิถีเมแทบอลิซึม MHC class I pathway) โดยเพิ่มยูบิควิตินซึ่งเป็นลำดับเพปไทด์ส่งสัญญาณ หรือโดยกลายพันธุ์ลำดับเพปไทด์ส่งสัญญาณอื่น ๆ พบว่ามีประสิทธิภาพเพิ่มการตอบสนองของ CTL การตอบสนองของ CTL ยังอาจเพิ่มได้ด้วยการฉีดโมเลกุลที่ร่วมกระตุ้น (co-stimulatory) วัคซีนดีเอ็นเอ โมเลกุลเช่น B7-1 หรือ B7-2 เพื่อต่อต้านนิวคลีโอโปรตีนของไข้หวัดใหญ่ หรือ GM-CSF เพื่อต่อต้านปรสิตมาลาเรีย Plasmodium yoelii ของหนู การฉีดวัคซีนดีเอ็นเอร่วมกับพลาดมิดที่เข้ารหัสโมเลกุลร่วมกระตุ้นเช่น IL-12 และ TCA3 พบว่าเพิ่มฤทธิ์ของ CTL ต่อแอนติเจนชนิดนิวคลีโอโปรตีนของ HIV-1 และไข้หวัดใหญ่

การตอบสนองทางน้ำเหลือง (สารภูมิต้านทาน)

แผนภาพเค้าร่างของแอนติบอดีและแอนติเจน

การตอบสนองของแอนติบอดี/สารภูมิต้านทานที่วัคซีนดีเอ็นเอชักนำอาศัยปัจจัยหลายอย่างรวมทั้งชนิดของแอนติเจน แหล่งที่พบแอนติเจน (เช่น ในเซลล์หรือหลั่งออก) จำนวนโดส ความถี่ ขนาดวัคซีน ตำแหน่งที่ฉีด และวิธีการส่งแอนติเจน

จลนศาสตร์

การตอบสนองทางน้ำเหลืองเพราะฉีดวัคซีนดีเอ็นเอครั้งเดียวอาจมีผลที่คงยืนกว่าการฉีดวัคซีนโปรตีนลูกผสมครั้งเดียวเหมือนกัน ยกตัวอย่างเช่น การตอบสนองทางสารภูมิต้านทานต่อโปรตีนเปลือกหุ้ม (HBsAg) ของไวรัสตับอักเสบบี อาจคงยืนถึง 74 สัปดาห์โดยไม่ต้องฉีดบูสต์ อีกอย่างหนึ่ง ภูมิคุ้มกันตลอดชีวิตต่อต้านไกลโคโปรตีน haemagglutinin ของไข้หวัดใหญ่ก็ทำได้แล้วในหนูเมื่อใช้ปืนยิงยีน เซลล์ที่หลั่งสารภูมิต้านทาน (antibody-secreting cell, ASC) จะเคลื่อนไปยังไขกระดูกและม้ามแล้วสามารถสร้างสารภูมิต้านทานในระยะยาว โดยจะอยู่เป็นประจำที่นั่นหลังจากปีหนึ่ง

ตารางต่อไปจะแสดงการตอบสนองทางสารภูมิต้านทานเมื่อติดเชื้อไวรัสโดยธรรมชาติ, เมื่อสร้างภูมิคุ้มกันด้วยโปรตีนลูกผสม (recombinant protein) และด้วยวัคซีนดีเอ็นเอ วัคซีนดีเอ็นเอจะเพิ่มการตอบสนองทางสารภูมิต้านทานได้ช้ากว่าการติดเชื้อหรือโปรตีนลูกผสม โดยอาจต้องใช้เวลานานถึง 12 สัปดาห์ แต่การฉีดบูสต์ก็ลดช่วงเวลานี้ได้เหมือนกัน นี้น่าจะเป็นเพราะระดับแอนติเจนที่แสดงออกได้น้อยเป็นเวลาหลายอาทิตย์ ซึ่งต้องสนับสนุนการตอบสนองของสารภูมิต้านทานทั้งในระยะปฐมภูมิและทุติยภูมิ

มีการฉีดวัคซีนดีเอ็นเอที่แสดงออกโปรตีนเปลือก (envelope protein) ทั้งขนาดเล็กขนาดกลางของไวรัสตับอักเสบบีให้แก่ผู้ใหญ่ที่เป็นโรคตับอักเสบเรื้อรัง ซึ่งทำให้เซลล์ผลิตไซโตไคน์โดยเฉพาะ คือ interferon gamma อนึ่ง เซลล์ทีซึ่งรู้จักโปรตีนเปลือกหุ้มขนาดกลางก็เกิดขึ้นด้วย แต่การตอบสนองทางภูมิคุ้มกันของคนไข้ก็ยังไม่พอควบคุมการติดเชื้อไวรัสบี

อนึ่ง ความเข้มข้นของสารภูมิต้านที่วัคซีนดีเอ็นเอชักนำก็จะน้อยกว่าที่ได้จากโปรตีนลูกผสม แต่สารภูมิต้านทานเนื่องกับวัคซีนดีเอ็นเอมีสัมพรรคภาพ (affinity) กับเอพิโทปที่พับอยู่ในสภาพปกติ (native epitope) ที่แน่นกว่าสารภูมิต้านทานเนื่องกับโปรตีน กล่าวอีกนัยก็คือ วัคซีนดีเอ็นเอก่อการตอบสนองเชิงคุณภาพที่ดีกว่า โดยสารภูมิต้านทานจะเกิดด้วยการฉีดเพียงครั้งเดียว เทียบกับโปรตีนลูกผสมที่ต้องฉีดบูสต์ วัคซีนดีเอ็นเอยังสามารถก่อการตอบสนองของเซลล์ TH ในรูปแบบที่ต้องการ และดังนั้น จึงชักนำสารภูมิต้านทานใน isotype ที่ต้องการได้อีกด้วย ซึ่งไม่เกิดกับการติดเชื้อตามธรรมชาติหรือการฉีดโปรตีนเป็นวัคซีน

กลไกของภูมิคุ้มกันเนื่องกับดีเอ็นเอ

DNA uptake

เมื่อพบเป็นครั้งแรกว่า เซลล์กล้ามเนื้อในร่างกายดูดซึมดีเอ็นเอแล้วแสดงออกโปรตีน ตอนนั้นก็ยังคาดว่าเป็นเซลล์พิเศษเพราะมี T-tubule เป็นเครือข่ายขนาดใหญ่ ต่อมาเมื่อตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนจึงเสนอว่า การดูดซึมดีเอ็นเอเข้าในเซลล์จะเกิดผ่านโครงสร้าง caveolae (หรือ non-clathrin coated pit) ที่เยื่อหุ้มเซลล์ แต่หลังจากนั้นกลับพบว่า เซลล์อื่น ๆ (เช่น keratinocyte, เซลล์สร้างเส้นใย และเซลล์เนื้อเยื่อบุผิวชนิดเซลล์ลังเกอร์ฮันส์) ก็สามารถนำดีเอ็นเอเข้าในเซลล์เหมือนกัน กลไกการนำดีเอ็นเอเข้าไปในเซลล์จึงยังไม่ชัดเจน

มีทฤษฎีหลักสองอย่าง คือ หนึ่ง เป็นการรับดีเอ็นเอเข้าไปอย่างไม่เฉพาะเจาะจง เช่น ดังที่พบในกระบวนการฟาโกไซโทซิสหรือพิโนไซโทซิส หรือ สอง เป็นการรับดีเอ็นเอเข้าไปผ่านหน่วยรับโดยเฉพาะ ๆ ซึ่งอาจรวม หน่วยรับที่ผิวเซลล์ขนาด 30 กิโลดัลตัน หรือหน่วยรับของแมคโครฟาจ หน่วยรับ 30 กิโลดัลตัน จะเข้ายึดอย่างเฉพาะเจาะจงกับส่วนดีเอ็นเอขนาด 4,500 bp (แล้วรับเข้าไปในเซลล์) โดยหน่วยรับพบอยู่ที่ antigen-presenting cell และเซลล์ที ส่วนหน่วยรับของแมคโครฟาจสามารถจับกับมาโครโมเลกุลหลายชนิด รวมทั้งโพลีไรโบนิวคลีโอไทด์ (polyribonucleotide) ซึ่งเป็นหน่วยโครงสร้างพื้นฐานของดีเอ็นเอและอาร์เอ็นเอ และดังนั้น จึงอาจเป็นตัวนำดีเอ็นเอเข้าไปในเซลล์ การดูดซึมดีเอ็นเอผ่านหน่วยรับอาจอำนวยโดยการมีลำดับยีนที่เป็นกัวนีนต่อ ๆ กัน (polyguanylate sequence) ในดีเอ็นเอ มีวิธีส่งวัคซีนอื่น ๆ ที่ไม่ส่งเข้าไปในเซลล์ผ่านกระบวนการเช่นนี้ เช่น ปืนยิงยีน และการส่งยีนโดยยึดไว้กับลิโปโซมเป็นต้น

การแสดงแอนติเจนของเซลล์

เซลล์เดนไดรต์

งานศึกษาต่าง ๆ กับหนูไคมีรา พบว่าเซลล์อนุพัทธ์จากเซลล์ไขกระดูกรวมทั้งเซลล์เดนไดรต์ แมคโครฟาจ และเซลล์บีที่ปรับตัวพิเศษ (specialized B cell) เป็นเซลล์แสดงแอนติเจนที่รวม ๆ เรียกว่า professional antigen presenting cellsเซลล์ลังเกอร์ฮันส์เป็นแมโครฟาจประจำเนื้อเยื่อผิวหนัง พบว่า หลังจากใช้ปืนยิงยีนเข้าที่ผิวหนัง เซลล์ลังเกอร์ฮันส์ที่ได้ดีเอ็นเอก็จะย้ายไปที่ต่อมน้ำเหลืองที่อยู่ใกล้ ๆ เพื่อแสดงแอนติเจน เทียบกับเมื่อฉีดวัคซีนในกล้ามเนื้อหรือในผิวหนัง จะเป็นเซลล์เดนไดรต์ที่ได้ดีเอ็นเอแล้วย้ายไปที่ต่อมน้ำเหลืองที่อยู่ใกล้ ๆ เพื่อแสดงแอนติเจน lj;oแมคโครฟาจที่ได้ดีเอ็นเออาจพบในเลือดที่เวียนไปในร่างกาย

นอกจากการส่งดีเอ็นเอเข้าไปในเซลล์เดนไดรต์และแมคโครฟาจโดยตรง (direct transfection) แล้ว ยังเกิดกระบวนการ cross priming เมื่อให้วัคซีนไม่ว่าจะโดยฉีดเข้ากล้ามเนื้อ เข้าผิวหนัง หรือผ่านปืนยิงยีน เมื่อเซลล์อนุพัทธ์ของเซลล์ไขกระดูกหนึ่งแสดงเพปไทด์ที่อีกเซลล์หนึ่งสังเคราะห์ขึ้นด้วย MHC class 1 กระบวนการนี้เรียกว่า cross priming ซึ่งเตรียมให้เซลล์ทีชนิดฆ่าเซลล์พร้อมในการตอบสนอง และดูจะสำคัญต่อความสมบูรณ์ในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันระยะปฐมภูมิ

เป้าหมาย

การฉีดวัคซีนเข้ากล้ามเนื้อและเข้าผิวหนังทำให้ภูมิคุ้มกันตอบสนองต่างกัน ที่ผิวหนัง เซลล์ประเภท keratinocyte, เซลล์สร้างเส้นใย และเซลล์ลังเกอร์ฮันส์ สามารถดูดซึมดีเอ็นเอแล้วแสดงแอนติเจนที่ชักนำให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันในระยะปฐมภูมิ เซลล์ลังเกอร์ฮันส์ที่ได้ดีเอ็นเอจะย้ายออกจากผิวหนัง (ภายใน 12 ชม.) เข้าไปยังต่อมน้ำเหลืองใกล้ ๆ ที่ ๆ เซลล์อำนวยให้เซลล์บีและเซลล์ทีตอบสนอง ในกล้ามเนื้อโครงร่าง แม้เซลล์กล้ามเนื้อลายจะเป็นเซลล์ที่รับดีเอ็นเอเข้าไปมากที่สุด ก็กลับไม่สำคัญต่อการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน แต่การฉีดดีเอ็นเอเข้ากล้ามเนื้อจะทะลักเข้าไปในต่อมน้ำเหลืองที่อยู่ใกล้ ๆ ภายในไม่กี่นาที แล้วเข้าไปในเซลล์เดนไดรต์ในที่นั้น ๆ แล้วก่อการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน ส่วนเซลล์กล้ามเนื้อ (myocyte) ที่ได้รับดีเอ็นเอแล้วจะเป็นหน่วยเก็บแอนติเจนสำรองเพื่อให้เซลล์แสดงแอนติเจน (APC) นำไปแสดง

การตอบสนองของภูมิคุ้มกันที่คงยืน

วัคซีนดีเอ็นเอมีประสิทธิภาพสร้างความจำให้แก่ภูมิคุ้มกัน เพราะมีการแสดงคอมเพล็กซ์แอนติเจน-แอนติบอดีที่ follicular dendritic cells (FDC) ซึ่งช่วยกระตุ้นเซลล์บีอย่างมีกำลัง แอนติเจนที่เซลล์เดนไดรต์แสดงใน germinal center ของต่อมน้ำเหลือง ก็ยังช่วยกระตุ้นเซลล์ทีอีกด้วย FDC ช่วยให้ภูมิคุ้มกันเกิดความจำเพราะช่วงการผลิตแอนติบอดีจะคาบเกี่ยวกับการแสดงออกของแอนติเจนที่เป็นไปในระยะยาว จึงสามารถเกิดคอมเพล็กซ์แอนติเจน-แอนติบอดีที่ FDC แสดงได้

อินเตอร์เฟียรอน

ทั้งเซลล์ทีเฮลเปอร์และเซลล์ทีชนิดเป็นพิษต่อเซลล์ (cytotoxic T-cell) สามารถควบคุมการติดเชื้อไวรัสโดยหลั่งอินเตอร์เฟียรอน แม้เซลล์ทีชนิดเป็นพิษปกติจะฆ่าเซลล์ที่ติดเชื้อไวรัส แต่ก็สามารถระตุ้นให้หลั่งไซโตไคน์ต่อต้านไวรัสเช่น IFN-γ (interferon gamma) และ TNF-α (tumor necrosis factor alpha) ซึ่งไม่ฆ่าเซลล์แต่จำกัดการติดเชื้อไวรัสโดยลด (down-regulating) การแสดงออกองค์ประกอบของไวรัสได้ ดังนั้น วัคซีนดีเอ็นเอจึงสามารถใช้บรรเทาการติดเชื้อไวรัสอาศัยอินเตอร์เฟียรอนที่ไม่ทำลายเซลล์ ซึ่งได้พิสูจน์แล้วกับเชื้อไวรัสตับอักเสบบี อนึ่ง IFN-γ เป็นโปรตีนส่งสัญญาณซึ่งสำคัญยิ่งในการควบคุมการติดเชื้อมาลาเรีย จึงมีลู่ทางว่าอาจใช้ทำวัคซีนดีเอ็นเอต้านมาลาเรียได้

การปรับการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน

ดูเพิ่ม

• ยีนบำบัด
• วัคซีนอาร์เอ็นเอ

แหล่งข้อมูลอื่น